Biología Molecular: estudiando la Varroaresistencia

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Los ácaros Varroa se reproducen en las celdas de cría, y se alimentan de la hemolinfa tanto de la cría, como de las abejas adultas. La infección con Varroa lleva a la reducción en el peso corporal y al contenido de nutrientes de las abejas parasitadas. Además, produce importantes daños porque en el proceso de alimentación Varroa transmite bacterias y virus patógenos para las abejas. Para controlar dicha enfermedad se utilizan acaricidas de síntesis como cumafós, amitraz, fluvalinato y flumetrina, sin embargo su uso indiscriminado e incorrecto ha generado la aparición de focos de resistencia en distintos lugares del mundo, y la acumulación de residuos en varios productos de la colmena (miel y cera principalmente). En estudios llevados a cabo en Argentina se desarrolló una metodología de laboratorio con la que se establecieron los niveles de CL50 (concentración a la cual mueren el 50% de los individuos) y se detectaron poblaciones resistentes a cumafós y amitraz en Argentina y a cumafós en Uruguay.

La detección temprana de la resistencia es crucial para reducir la pérdida de colonias y la diseminación de la resistencia. Sin embargo, hasta el momento, el único modo de distinguir la presencia de ácaros resistentes es a través de la realización de bioensayos que permitan detectar cambios en la susceptibilidad a acaricidas a través del tiempo. El estudio de los mecanismos de resistencia puede permitir el desarrollo de nuevas técnicas para la detección temprana de la misma de manera de favorecer un mejor manejo de la Varroosis.

Los ácaros se pueden volver resistentes a un acaricida por distintos mecanismos: I) reducir la penetración de la droga; II) incrementar el secuestro o excreción del compuesto, o ambos; III) resistencia relacionada a cambios comportamentales; IV) resistencia metabólica; V) insensibilidad del  sitio blanco. Este último se refiere al escenario en el cual se produce una alteración en el sitio en el cual el acaricida interactúa, o ejerce su efecto.

Los piretroides (familia a la que pertenecen la flumetrina y el fluvalinato) ejercen su efecto uniéndose a los canales de sodio de las células nerviosas, y de esta manera se producen descargas repetitivas en las células nerviosas, causando la parálisis y muerte posterior del ácaro. En poblaciones de Varroa resistentes a piretroides se han observado varias mutaciones en el gen que codifica para el canal de sodio, muchas de las cuales están localizadas en los dominios II y III del segmento transmembrana.

En este contexto es importante por un lado continuar realizando estudios para monitorear las poblaciones de Varroa de manera de poder determinar nuevos focos de resistencia a acaricidas, y por otra parte profundizar en el estudio de los mecanismos de resistencia para poder desarrollar nuevas técnicas de determinación de poblaciones resistentes.

 

Biología molecular

La biología molecular es una disciplina que utiliza las herramientas de la ingeniería genética para estudiar diversos tipos de sistemas, se encarga de estudiar el ADN, que contiene la información genética de cada individuo. El surgimiento en las últimas décadas de métodos de estudio del ADN como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y más recientemente de la PCR en tiempo real, permiten realizar un análisis de muestras a partir de muy poco material biológico, favoreciendo la obtención de resultados de forma rápida y altamente específicos. La utilización de estas herramientas para el estudio de la resistencia de acaricidas permitiría una detección más eficaz y en una etapa temprana, de modo que se puedan implementar las estrategias de control adecuadas.

En un apiario de Colonia, Uruguay, se observaron altos niveles de Varroa luego del tratamiento con flumetrina, por lo que se realizaron estudios para estimar la susceptibilidad a flumetrina y establecer la posible asociación de una mutación en el gen del canal de sodio en la resistencia a dicho compuesto.

 

Bioensayos

Se determinaron las CL50 para flumetrina para ambas poblaciones de estudio, siguiendo la metodología descripta por Maggi y col. (2008). Para la población de Colonia, fueron aplicadas en cápsulas de Petri que quedaron abiertas hasta la evaporación del hexano concentraciones crecientes de 0 a 20 μg/ml; mientras que para la población de Treinta y Tres se aplicaron concentraciones crecientes de 0 a 2 μg/ml. Posteriormente se incorporaron 5 ácaros y 3 abejas en cada cápsula de Petri. Se realizaron 5 réplicas por tratamiento. Los controles se realizaron con hexano. Luego de 24 horas de iniciados los bioensayos, se registró el número de ácaros muertos para cada tratamiento. Los ácaros vivos y muertos se conservaron en etanol 96% para los estudios moleculares.

 

Resultados y discusión

En los bioensayos realizados para la población de Colonia fueron necesarios 3.8 µg/cápsula de Petri para matar al 50%  de los ácaros (CL50). Mientras que la CL50 obtenida para la población de Treinta y Tres fue de 0.11 µg/cápsula de Petri. Es decir que, se observó un incremento en la CL50 de Colonia de 34.5 veces cuando se compara con la CL50 de la población de Treinta y Tres, siendo esta última una población susceptible a la flumetrina. Además si comparamos la CL50 obtenida para la población de Colonia con los resultados obtenidos por Maggi y col. (2008) para una población susceptible a flumetrina de Argentina se obtiene un incremento en la CL50 en 11.18 veces. Estos resultados sugerirían el desarrollo de resistencia a la flumetrina por parte de la población de ácaros de Colonia.

Al realizar los estudios moleculares se observó que los ácaros de la población de Colonia, resistentes a flumetrina presentaron una mutación en la secuencia de ADN del gen que codifica  para el canal de sodio. En estos ácaros se observó la presencia de guanina y la ausencia de citosina que, en la proteína resulta en un cambio del aminoácido leucina por valina, dando una proteína del canal de sodio diferente. Los ácaros de la población de Treinta y Tres, población susceptible a la flumetrina, no presentaron dicha mutación. Dicha mutación se da en una región de la proteína en la que estaría el sitio de unión de la flumetrina al canal de sodio16, de manera que, en los ácaros resistentes el hecho de tener modificado un aminoácido en el sitio de unión de la proteína podría afectar en que la flumetrina no se una al canal de sodio y por lo tanto ésta no pueda ejercer su efecto.

 

Conclusiones

Este estudio constituye el primer reporte de resistencia a flumetrina en una población de ácaros de Uruguay. Mediante técnicas de biología molecular fue posible detectar una mutación en el gen que codifica para el canal de sodio, en los ácaros de la población de Colonia, mientras que en los ácaros de la población de Treinta y Tres, susceptibles a la flumetrina no se encontró dicha mutación. Estos resultados indicarían que la mutación encontrada estaría relacionada con la resistencia a flumetrina. El estudio y la comprensión de los mecanismos de resistencia a acaricidas son de gran importancia para el desarrollo de metodologías que permitan realizar diagnósticos tempranos de resistencia de modo de poder tomar decisiones en relación a las estrategias a utilizar para contener y mitigar los efectos de esta problemática.

 

Trabajo de investigación realizado por: GiuliaMitton, Silvina Quintana, Pablo GimenezMartinez, Yamandú Mendoza, Gustavo Ramallo, Sandra Medici, Martín Javier Eguaras, Matías Maggi y Sergio Ruffinego.

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  1. la barroa no nos va a matar lo que va a matar a los apicultores es el bajo precio de la miel