Virus asociados a la degeneración ovárica

 

La fecundidad de la reina es un factor clave para la salud de las colonias de abejas, ya que es la única hembra reproductora y por consiguiente la responsable de la renovación constante de la población de obreras. Cualquier factor que afecte la fecundidad de la reina estancará el desarrollo de las colonias, aumentando su susceptibilidad a patógenos oportunistas. Se descubrió una patología que afecta a los ovarios, caracterizada por una decoloración amarilla concentrada en el ápice de los mismos, resultado de lesiones degenerativas en los folículos. En los casos extremos, marcados por una intensa decoloración, la mayoría de los ovarioles fueron afectados y estos casos fueron universalmente asociados con las deficien¬cias de colocación de huevos en las reinas. El examen microscópico de los folículos degenerados mostró extensas redes paracristales de partículas virales icasaédricas de 30 milímetros.
La reina es la única hembra reproductora de la colonia, produciendo un gran número de hijas estériles (abejas obreras) que realizan todas las tareas de mantenimiento de las colonias, principalmente cuidado de la cría, defen¬sa de colonias, construcción y forraje. Durante la estación activa (primavera a otoño en climas templados), la población de abejas trabajadoras es constantemente reemplazada, ya que la vida promedio es de sólo unas pocas semanas.
Por el contrario, durante la temporada inactiva (invierno en climas templados), la reina reduce su actividad de puesta de huevos y las abejas de invierno pueden sobrevivir durante meses con las reservas de alimentos almacenados en las colonias. El polifenismo de las abejas (la separación de las hembras en castas reproductivas y no reproductivas) se determina por cambios discretos durante el desarrollo postembryonic, comenzando con la alimentación diferencial de las larvas femeninas. Las larvas destinadas a convertirse en reinas son alimentadas con secreciones glandulares ricas en proteínas (jalea real) segregadas por las abejas enfermeras en cantidades mucho mayores y durante toda la duración del desarrollo larvario, mientras que las larvas de abejas trabajadoras reci¬ben esto en cantidades mucho menores y por sólo unos pocos días antes de cambiar a una mezcla de azúcares y jalea real basada en la dieta. Los estímulos nutricionales afectan el TOR vía reguladora y desencadenan una respuesta endocrina manifestada por un título de la hormona juvenil elevada en larvas reinas, en comparación con las larvas de abejas trabajadoras.
Estos cambios dan lugar a una marcada diferencia entre las dos castas femeninas en el número de ovarioles producidos, que oscilan entre 180 y 200 por ovario en las reinas y entre 2 y 12 por ovario en las abejas obreras. Se ha demostrado que el alto título de la hormona juvenil en larvas reinas impide la inducción de la muerte celular programada en los ovarioles al inicio de la metamorfosis. Esto significa que la mayoría de los ovarioles degeneran en las abejas obreras, mientras que en las reinas todas sobreviven y se diferencian durante el desarrollo. En el ovariole se distinguen dos regiones: el filamento superior y el germario, donde los folículos se inician y se diferencian en ovocitos y enfermeras, y el vitellario, donde crecen los ovocitos hasta su liberación en los oviductos. En el vitellarium, cada ovocito se asocia a un grupo de células hermanas cuya función es llenar el ovocito con reservas alimentarias que serán utilizadas por el futuro embrión. Una vez que el desarrollo del ovocito se ha completado, las células enfermeras degeneran. Se estima que se producen de 3 a 5 folículos diarios en cada ovariole. Además de su papel como una máquina de puesta de huevos, la reina libera diferentes ramos de feromonas que mantienen la cohesión social de la colonia.
A pesar de la posible relevancia para los eventos de colapso de la colonia, ha habido muy pocos estudios centrados en las enfermedades de la reina de abejas.
Aquí presentamos por primera vez una patología en la que se encontraron numerosas partículas virales asociadas con los folículos de ovariole en degeneración, lo que en casos extremos se asoció además con graves problemas de fecundidad de las reinas afectadas. Las únicas secuencias de virus recuperadas en abundancia a partir de una biblioteca de cDNA de tales folículos degenerados fueron para DWV y el virus de Varroa destructor 1 estrechamente relacionado. La hibridación in situ confirmó que DWV y VDV-1 estaban distribuidos extensamente a través de los tejidos ováricos, y por lo tanto la identidad más probable de las partículas víricas en los folículos degenerados. Sin embargo, estos datos muestran que, a pesar de su asociación con esta patología, estos dos virus generalmente muestran una baja virulencia cuando infectan a los órganos reproductores de la reina, con poco efecto sobre la función de la reina o la aptitud, sugiriendo que otros factores también están implicados en esta patología.

Diseño de los experimentos

Se llevaron a cabo dos series de experimentos:
A: Encuesta de reinas apareadas en Francia
Se recibieron un total de 130 reinas acopladas (Apis de apicultores franceses durante dos años (muestreo A). Las reinas eran de uno, dos o tres años de edad, con un número aproximadamente igual de cada clase de edad. La mayoría de las reinas de 1 año fueron removidas por los apicultores debido a los problemas de fecundidad de la reina y el débil desarrollo de la colonia. Las reinas de 2 y 3 años generalmente fueron removidas por los apicultores como parte de un plan de manejo regular, independientemente de si presentaban o no deficiencias de postura. Ochenta y ocho reinas fueron disecadas y examinadas para la presencia de patologías internas. Los tejidos de las 130 reinas también se procesaron para la extracción de ARN, con el fin de cuantificar la cantidad de ARN de virus de ala deformado utilizando RT-qPCR cuantitativa. Entre estas 130 muestras, un subconjunto de 30 reinas se analizó la presencia de 10 diferentes virus de la abeja utilizando clásica RT-PCR cualitativa ensayos.
A modo de comparación, se analizó una muestra de 40 reinas vírgenes, criadas en diferentes apiarios del sur de Francia, para estos 10 virus de abejas.
B: Impacto de las infecciones por DWV y VDV-1 en la fecundidad de la reina
En este experimento, 59 reinas apareadas de 2 años de edad fueron recolectadas de un único colmenar ubicado en el sur de Francia en 2008 (muestreo B). Todas estas reinas tenían características altas de la aptitud y de la fecundidad y dirigieron las colonias fuertes de la produc¬ción de la miel el año anterior. Después de la disección, los ovarios fueron cuidadosamente comprobados para la presencia de síntomas de decoloración amarilla. De esta muestra, se eligieron 12 reinas con ovarios amarillentos y 12 reinas con ovarios normales para un análisis detallado, y sus ovarios y abdomen fueron preparados individualmente para la extracción de ARN. Se determinó la presencia de los 10 diferentes virus de la abeja en estas muestras utilizando RT-PCR cualitativa. Entonces, con el fin de buscar el posible impacto de la infección viral en la función ovárica, se determinó por RT-qPCR las cantidades de DWV y VDV-1 genómica ARN, así como la expresión relativa de mRNA de dos genes relevantes para la salud y la función ovario reina Vitelogenina y el receptor de vitelogenina, utilizando β-actina como un “neutro” referencia interna de genes para la normalización de datos, y comparó la expresión relativa en los ovarios con la correspondiente a los abdómenes.

Prevalencia de virus de abejas en reinas
Con el fin de identificar aún más los virus detectados en los ovarios de reina por microscopía electrónica, se analizó un subconjunto de las muestras de reina cruzada que se recibieron de varios lugares de Francia (muestreo A) para la presencia o ausencia de 10 diferentes virus de abejas. A modo de comparación, también se anali¬zaron 40 reinas vírgenes de varios apiarios y 24 reinas acorazadas sanas, la mitad con coloración de ovario y la otra mitad, recogidas en un solo colmenar en el sur de Francia (muestreo B, Figura 3). Sólo se detectaron DWV (37%), virus sacbrood (SBV) (5%) y virus de la reina. Por el contrario, se identificaron cinco virus en las reinas acopladas: DWV, SBV, BQCV, VDV-1 y virus israelí de parálisis aguda (IAPV), con el 83% de las reinas infectadas por más de un virus. Sin embargo, los virus no estaban distribuidos equitativamente entre los muestreos A y B. Aunque se detectó DWV en todas las reinas acopladas que se analizaron, se registraron valores de prevalencia muy distintos para SBV (3% y 29% en las muestreos A y B respectivamente); BQCV (63% y 4% en los muestreos A y B, respectivamente); VDV-1 (67% y 100% en el muestreo A y B respectivamente) y IAPV (10% y 8% en los mues¬treos A y B, respectivamente).
No se detectaron virus de tipo Macula (VdMLV), virus de parálisis de abejas agudas (ABPV), virus de parálisis de abejas crónicas (CBPV), virus de parálisis de abejas lentas (SBPV) y virus de Caxemira (KBV). No se encontró asociación entre la detección cualitativa de ninguno de estos virus y la alteración de la puesta de huevos, la edad de la reina o los síntomas del ovario amarillento, y tampoco hubo asociación entre los diferentes patógenos.

Infecciones por virus en reinas
Aunque hay muchos virus que pueden infectar abejas, muchos no se detectaron en estas muestras de reina. En este caso, se encontró que las reinas estaban infectadas por DWV, VDV-1, BQCV, IAPV y SBV, mientras que las muestras eran negativas para CBPV, ABPV, SPV, KBV y VdMLV. Una encuesta de virus similar realizada en Es¬tados Unidos a partir de 30 reinas acopladas recogidas en el mismo apiario mostró la presencia de DWV, BQCV, SBV, CBPV y KBV, pero no ABPV. Ambas encuestas tuvieron una alta incidencia de coinfección (83% en estas muestras y 93% en Estados Unidos), siendo DWV (100% en ambas encuestas) y BQCV (63% en esta encuesta y 86% en EE.UU. Virus prevalentes. Estudios anteriores de Australia utilizando un método de detección inmunológica también demostró que BQCV era muy prevalente en las reinas.

Conclusiones
Aquí presentamos una condición patológica recién descubierta de reinas de abejas melíferas que en casos extremos puede conducir a un deterioro completo del ovario. Estas lesiones se encontraron asociadas con partículas virales en matrices paracristalinas masivas. Los estudios de hibridación molecular e in situ identificaron que estos virus eran más probable DWV y / o VDV-1. Sin embargo, una encuesta grande de reinas mostró que en general, las infecciones por DWV y VDV-1 tuvieron poco impacto en la salud y el estado funcional de la reina, al menos en los tejidos y en los títulos encontrados aquí, sugiriendo que en la mayoría de los casos la patología puede ser compensada a nivel funcional. Esto sugiere que la acu¬mulación de partículas virales en los ovarios de reinas por encima de cierto umbral puede conducir a los síntomas patológicos que observamos en algunos casos, aunque también podrían estar involucrados otros factores en este fenómeno, incluyendo patógenos aún no descriptos (virales) o la acumulación de toxinas químicas a través de las grandes cantidades de alimentos ingeridos por la reina durante su vida y la presencia de muchos residuos químicos en el polen. Estas posibilidades adicionales requieren futuras investigaciones.